Assessment of genotyping markers in the molecular characterization of a population of clinical isolates of Fusarium in Colombia / Evaluación de marcadores de genotipificación en la caracterización molecular de una población de aislamientos clínicos de Fusarium en Colombia

Introduction: Fusarium is a very heterogeneous group of fungi, difficult to classify, with a wide range of living styles, acting as saprophytes, parasites of plants, or pathogens for humans and animals. Prevalence of clinical fusariosis and lack of effective treatments have increased the interest in the precise diagnosis, which implies a molecular characterization of Fusarium populations. Objective: We compared different genotyping markers in their assessment of the genetic variability and molecular identification of clinical isolates of Fusarium. Materials and methods: We evaluated the performance of the fingerprinting produced by two random primers: M13, which amplifies a minisatellite sequence, and (GACA)4, which corresponds to a simple repetitive DNA sequence. Using the Hunter Gaston Discriminatory Index (HGDI), an analysis of molecular variance (AMOVA), and a Mantel test, the resolution of these markers was compared to the reference sequencing-based and PCR genotyping methods. Results: The highest HGDI value was associated with the M13 marker followed by (GACA)4. AMOVA and the Mantel tests supported a strong correlation between the M13 classification and the reference method given by the partial sequencing of the transcription elongation factor 1-alpha (TEF1-α) and rDNA 28S. Conclusion: The strong correlation between the M13 classification and the sequencing-based reference together with its higher resolution demonstrates its adequacy for the characterization of Fusarium populations.

Introducción. Fusarium es un grupo heterogéneo de hongos, difícil de clasificar y con una amplia gama de estilos de vida, que actúa como saprófito, parásito de plantas o patógeno de humanos y animales. La prevalencia de la fusariosis clínica y la falta de tratamientos han incrementado el interés en su diagnóstico preciso, lo que conlleva la caracterización molecular de las poblaciones. Objetivo. Comparar marcadores de genotipificación en la evaluación de la variabilidad genética e identificación de aislamientos clínicos de Fusarium. Materiales y métodos. Se evaluó la huella genética producida por dos cebadores aleatorios: M13, que amplifica una secuencia minisatélite, y (GACA)4, que corresponde a una secuencia repetitiva de ADN. Utilizando el índice discriminatorio de Hunter Gaston (HGDI), el análisis de varianza molecular (AMOVA) y una prueba de Mantel, se comparó la resolución de estos marcadores con métodos de genotipificación basados en secuenciación y PCR. Resultados. El mayor HGDI se asoció con el marcador M13, seguido de (GACA)4. Las pruebas AMOVA y Mantel mostraron correlación entre las clasificaciones obtenidas con M13 y la referencia basada en la secuenciación parcial del factor de elongación de transcripción 1-alfa (TEF1-α) y el ADNr 28S. Conclusión. La fuerte correlación entre la clasificación obtenida con M13 y el método de referencia, así como su alta resolución, demuestran su idoneidad para la caracterización de poblaciones de Fusarium.

Concordance analysis between different methodologies used for identification of oral isolates of Candida species / Análisis de concordancia de diferentes metodologías para la identificación de aislamientos orales de especies de Candida

Abstract Background: The yeasts species determination is fundamental not only for an accurate diagnosis but also for establishing a suitable patient treatment. We performed a concordance study of five methodologies for the species identification of oral isolates of Candida in Colombia. Methods: Sixty-seven Candida isolates were tested by; API® 20C-AUX, Vitek®2 Compact, Vitek®MS, Microflex® and a molecular test (panfungal PCR and sequencing). The commercial cost and processing time of the samples was done by graphical analysis. Results: Panfungal PCR differentiated 12 species of Candida, Vitek®MS and Microflex® methods identified 9 species, and API® 20C-AUX and Vitek®2 Compact methods identified 8 species each. Weighted Kappa (wK) showed a high agreement between Panfungal PCR, Vitek®MS, Microflex® and API® 20C-AUX (wK 0.62-0.93). The wK that involved the Vitek®2 Compact method presented moderate or good concordances compared with the other methods (wK 0.56-0.73). Methodologies based on MALDI TOF MS required 4 minutes to generate results and the Microflex® method had the lowest selling price. Conclusion: The methods evaluated showed high concordance in their results, being higher for the molecular methods and the methodologies based on MALDI TOF. The latter are faster and cheaper, presenting as promising alternatives for the routine identification of yeast species of the genus Candida.

Resumen Introducción: La clasificación a nivel de especies de las levaduras del género Candida de origen clínico es fundamental para el diagnóstico y la instauración de un adecuado tratamiento para el paciente. Se realizó un estudio de concordancia de cinco metodologías usadas para la identificación de aislamientos orales de Candida spp en Colombia. Métodos: Sesenta y siete aislamientos de Candida spp fueron identificados a nivel de especie utilizando; API® 20 C AUX‚ Vitek® 2 Compact, MALDI TOF (Vitek® MS y Microflex®) y una prueba molecular, PCR Panfungal y secuenciación. Un análisis del costo comercial y tiempo de procesamiento de las muestras por cada método fue realizado mediante el análisis gráfico de ambas variables. Resultados: La PCR Panfungal y secuenciación diferenció 12 especies de Candida‚ los métodos Vitek® MS y Microflex® identificaron 9 especies y los métodos API® 20 C AUX y Vitek® 2 Compact identificaron 8 especies. El análisis de Kappa ponderado (wK) demostró una concordancia alta entre los métodos PCR Panfungal y secuenciación‚ Vitek® MS‚ Microflex® y API® 20 C AUX‚ concordancias agrupadas en las categorías buena y muy buena (wK 0.62 - 0.93); los Kp que involucraron el método Vitek® 2 Compact presentaron concordancias moderadas o buenas frente a los otros métodos (wK 0.56 - 0.73). Las metodologías basadas en MALDI TOF MS requirieron 4 minutos para generar un resultado y el método Microflex® fue el método que en nuestro medio presentó el menor precio de venta del servicio. Conclusión: Los métodos evaluados presentaron una alta concordancia en sus resultados‚ siendo más alta para los métodos moleculares y las metodologías basadas en MALDI TOF MS; estas últimas son metodologías más rápidas, económicas y precisas, las cuales se presentan como alternativas prometedoras para la identificación rutinaria de especies de levaduras del género Candida.

Epidemiología de la tinea capitis: 19 años de experiencia en un laboratorio clínico especializado en Colombia / Epidemiology of tinea capitis: A 19 years' experience in a Colombian, specialized clinical laboratory

Introducción: En la literatura colombiana son escasos los reportes acerca de la epidemiología de la tinea capitis. Objetivo : Realizar un estudio retrospectivo para describir el comportamiento de esta micosis y de sus agentes etiológicos, en una serie de pacientes remitidos a un centro de diagnóstico especializado en Medellín, Colombia. Métodos : Estudio retrospectivo donde se analizaron los registros de pacientes remitidos entre los años 1994 y 2013 para estudio micológico a la Unidad de Micología Médica y Experimental de la Corporación para Investigaciones Biológicas (CIB), en Medellín, Colombia. Resultados : Fueron analizados 415 pacientes con sospecha clínica de tinea capitis, 133 (32%) de los cuales fueron confirmados por el laboratorio. La mayoría de los pacientes positivos, 124/133 (93%), fueron menores de edad y 89/133 (67%) correspondieron al sexo masculino. En 52 de los 133 casos comprobados se pudo determinar algún factor de riesgo asociado: el contacto con animales fue el principal factor de riesgo en 39/52 pacientes (75%). El examen directo fue positivo en el 87% y el cultivo para hongos en el 92% de los casos comprobados. El agente etiológico más frecuentemente aislado fue Microsporum canis (86%), seguido con una amplia diferencia por Microsporum gypseum(4%), Trichophyton tonsurans (3%), Trichophyton mentagrophytes (3%), Microsporum audouinii (3%) y Microsporum spp. (1%). Conclusión : Nuestros resultados representan una casuística importante para la epidemiología de la tinea capitis en Colombia. En ausencia de estudios más extensos en cobertura geográfica y en población estudiada que permitan conocer la incidencia real de esta micosis en nuestro medio, estos datos deben ser considerados como aporte valioso en el conocimiento de los agentes etiológicos de tinea capitis más frecuentes en el país.

Introduction: There are few written reports on the epidemiology of tinea capitis in Colombia. Objective: To undertake a retrospective study (1994-2013) aimed at describing the behavior of this mycosis and its etiological agents, using a series of patients referred to a specialized diagnostic center in Medellin, Colombia. Methods: This is a retrospective study in which the records were analysed of patients from 1994-2013, who were referred for mycological studies (direct examination and culture) to the Medical and Experimental Mycology Unit of the Corporación para Investigaciones Biológicas (CIB) with the clinical suspicion of tinea capitis. Results: In this period, 415 patients with clinical suspicion of tinea capitis were reported, of which 133 cases were confirmed by the laboratory (32%); most patients 124 (93%) were children, mostly boys 89 (67%). In terms of associated risk factors there was information from 52 confirmed cases, of which 39 (75%) had contact with animals. Direct examination was positive in 87% and fungal culture in 92% of confirmed cases; the etiologic agent most isolated was Microsporum canis (86%), followed by Microsporum gypseum (4%), Trichophyton tonsurans (3%), Trichophyton mentagrophytes (3%), Microsporum audouinii (3%) and Microsporum spp. (1%). Conclusion: Our results represent an important casuistry for the epidemiology of tinea capitis in Colombia. In the absence of more extensive studies on geographic coverage and population characteristics that reveal the true incidence of this mycosis in our country, these data should be considered a valuable contribution to the understanding of the most frequent etiologic agents of tinea capitis in Colombia.

Detección e identificación de Histoplasma capsulatum por el laboratorio: de los métodos convencionales a las pruebas moleculares / Detection and identification of the fungal pathogen Histoplasma capsulatum: from conventional to molecular methods

La histoplasmosis, micosis sistémica y endémica en una amplia zona de las Américas, es causada por el hongo dimórfico Histoplasma capsulatum. Tradicionalmente, el diagnóstico de esta entidad se realiza por métodos microbiológicos directos y biopsias que emplean una variedad de coloraciones especiales tales como Wright, Giemsa y plata metenamina, entre otras, así como por cultivo; este último representa el estándar de oro. Se emplean, igualmente, métodos indirectos que incluyen la detección de anticuerpos y antígenos. Los valores de sensibilidad y especificidad en ambos métodos son variables, y los resultados dependen, a su vez, de la forma clínica de la enfermedad que presente el paciente y de su estado inmune. Recientemente, la biología molecular ha permitido introducir nuevas herramientas que han sido utilizadas para la detección e identificación de H.capsulatum, una de ellas es la PCR anidada que se caracteriza por sus altos niveles de sensibilidad y especificidad. De igual forma, estas técnicas moleculares han permitido realizar análisis evolutivos, estudios de diversidad genética y un sinnúmero de estudios de epidemiología molecular, a partir de los cuales se ha logrado recopilar información valiosa sobre la variabilidad genética de este microorganismo. En esta revisión se describen los métodos de laboratorio convencionales y las técnicas moleculares más empleadas para el diagnóstico de la histoplasmosis; así como también algunas de sus aplicaciones en la epidemiología y biología molecular de este hongo.

Histoplasma capsulatum is the causative agent of histoplasmosis, a systemic and endemic mycosis widely distributed in the Americas. Diagnosis of histoplasmosis is traditionally accomplished by means of direct preparations and biopsies stained by especial methods, as well as by isolation of fungus in culture; the latter is considered the gold standard. Indirect methods, including immunological tests to detect antibodies and/or antigens, are also valuable; both direct and indirect methods present sensitivity and specificity ranges that vary depending on the clinical form of the disease and the immune status of the host. Recently, molecular biology has allowed implementing new tools to detect and identify H. capsulatum, and several molecular tests, such as nested-PCR, are being used for the diagnosis of histoplasmosis, and so provide high sensitivity and specificity values. In addition, these molecular techniques have made it possible to perform evolution analysis, genetic diversity research, and molecular epidemiology, thus compiling valuable information on the genetic variability of this microorganism. In this review, the conventional and molecular methods employed for the diagnosis of histoplasmosis have been described, as have some of the applications of these molecular techniques to this fungal pathogen's epidemiology and molecular biology.

Role of iron in the nitric oxide-mediated fungicidal mechanism of IFN-gamma-activated murine macrophages against Paracoccidioides brasiliensis conidia

Iron is an essential growth element of virtually all microorganisms and its restriction is one of the mechanisms used by macrophages to control microbial multiplication. Paracoccidioides brasiliensis, the agent of paracoccidioidomycosis, an important systemic mycosis in Latin America, is inhibited in its conidia-to-yeast conversion in the absence of iron. We studied the participation of iron in the nitric oxide (NO)-mediated fungicidal mechanism against conidia. Peritoneal murine macrophages activated with 50U/mL of IFN-gamma or treated with 35 æM Deferoxamine (DEX) and infected with P. brasiliensis conidia, were co-cultured and incubated for 96 h in the presence of different concentrations of holotransferrin (HOLO) and FeS0(4). The supernatants were withdrawn in order to assess NO2 production by the Griess method. The monolayers were fixed, stained and observed microscopically. The percentage of the conidia-to-yeast transition was estimated by counting 200 intracellular propagules. IFN-gamma-activated or DEX-treated Mthetas presented marked inhibition of the conidia-to-yeast conversion (19 and 56 percent, respectively) in comparison with non-activated or untreated Mthetas (80 percent). IFN-gamma-activated macrophages produced high NO levels in comparison with the controls. Additionally, when the activated or treated-macrophages were supplemented with iron donors (HOLO or FeSO4), the inhibitory action was reversed, although NO production remained intact. These results suggest that the NO-mediated fungicidal mechanism exerted by IFN-gamma-activated macrophages against P. brasiliensis conidia, is dependent of an iron interaction.

O ferro é elemento essencial para o crescimento de microrganismos e sua limitação é um dos mecanismos usados por macrófagos para controlar a multiplicação microbiana. Paracoccidioides brasiliensis, o agente da paracoccidioidomicose, uma das micoses sistêmicas mais importantes na América Latina, é inibido em sua conversão de conídia-à-levedura na ausência do ferro. Estudamos a participação do ferro no mecanismo fungicida mediado pelo óxido nítrico (NO) na sua interação com as conídias do fungo. Macrófagos peritoneais murinos ativados com 50U/mL de IFN-gama ou tratados com 35 æM Deferoxamina (DEX) e infectados com conídias do P. brasiliensis foram co-cultivados e incubados por 96 h na presença de concentrações diferentes de holotransferrina (HOLO) e FeS0(4). Os sobrenadantes foram retirados a fim de avaliar a produção de NO2 pelo método de Griess. Os macrófagos eram fixados, corados e observados ao microscópio. A porcentagem da transição de conídia-à-levedura foi estimada contando 200 propágulos intracelulares. Os macrófagos ativados com citocina ou tratados com DEX apresentaram inibição marcada da conversão de conídia-à-levedura (19 e 56 por cento, respectivamente) em comparação com macrófagos controle (80 por cento). Os macrófagos ativados com IFN-gama produziram elevação nos níveis de NO em comparação com macrófagos não-tratados ou não-activados. Adicionalmente, quando as monocapas ativadas ou tratadas foram suplementadas com doadores do ferro (HOLO ou FeSO4), a ação inibitória foi revertida embora a produção de NO permanecesse intacto. Estes resultados sugerem que o mecanismo fungicida mediado pelo NO exercido por macrófagos ativados com IFN-gama contra conídias do P. brasiliensis é dependente de uma interação do ferro.

Participación del polimorfismo neutrófilo en la respuesta inmune contra Paracoccidioides brasiliensis / Polymorphonuclear neutrophil prticipation in immune response to Paraccocidioides brasiliensis

La paracoccidioidomicosis, micosis profunda de gran importancia en Latinoamérica, se caracteriza por presentar una respuesta inflamtoria aguda en el pulmón, órgano blanco del proceso infeccioso. En las etapas iniciales, esta respuesta se caracteriza principalmente por un infiltrado de polimorfonucleares neutrófilos (PMN), los que, de acuerdo con estudios histopatológicos y de lavados broncoalveolares, representan más del 85 por ciento de las células allí presente. Las evidencias presentadas en esta revisión sugieren que el PMN participa activamente en la respuesta inflamatoria aguda inducida por Paracoccidioides brasiliensis, como lo demuestra la inhibición de su crecimiento después de su interacción con tales PMN. Igualmente, se conoce que algunas etapas del mecanismo fungicida exhibido por esta célula fagocítica están mediadas por los reactivos intermediarios del oxígeno, así como también por el efecto activador de algunas citocinas como IFN gamma, GM-CSF e IL-1ß. En efecto, fracciones o componentes del hongo inducen la migración al sitio inflamatorio y la activación de los PMN, evidenciada por el aumento en los productos del estallido respiratorio

Factores genéticos y su influencia en las micosis sistémicas / Genetic factors and their influence in systemic micoses

La respuesta defensora del hospedero frente a la infección microbiana depende de múltiples mecanismos, entre los cuales las características genéticas del hospedero juegan papel importante, ya que condicionan tanto la resistencia natural como la adquirida. La mayoría de hallazgos en este campo en micosis sistémicas, se ha evidenciado en el modelo animal. En estas enfermedades, uno de los componentes genéticos más estudiados ha sido el complejo mayor de histocompatibilidad (CMH). Sin embargo, en ratones consaguíneos no se ha demostrado la existencia de una relación entre estos genes y la respuesta inmune desencadenada contra los agentes causales de tales micosis. Con relación a otros factores, como el sistema del complemento, se ha podido establecer una asociación solamente en el caso de la criptocosis. En cepas consanguíneas de ratón, los patrones de resistencia y susceptibilidad a Cryptococcus neoformans dependen de la presencia o ausencia del gen correspondiente, C superíndice 1 o Cº, repectivamente. Por otra parte, en un buen número de las micosis que se mencionan, se ha demostrado que la respuesta inmune mediada por células, es fundamental para su control. En la coccidioidomicosis y la paracoccidioidomicosis, la función de las células T es decisiva, a diferencia de lo observado en candidiasis, en la cual la principal célula efectora parece ser el polimorfonuclear. En cuanto al patrón de citocinas, se ha observado que los ratones suscptibles a Coccidioides immitis o Paracoccidioides brasiliensis, al ser infectados con estos hongos, producen predominante y tempranamente citocinas tipo TH2, IL-10 e IL-4 en coccidioidomicosis e IL-10 e IL-5 en paracoccidioidomicosis. En la histoplasmosis, los estudios han señalado la importancia del IFN gamma en la defensa. Hasta el presente, sólo se conocen genes específicos que determinan la respuesta inmune en la candidiasis, Carg1 y Carg2. En la coccidioidomicosis, se han sugerido dos genes, Cms1 y Cms2. En las micosis que se describen a continuación, el gen o los genes que condicionarían la respuesta correspondene son de tipo autosómico y el fenotipo de resistencia es el dominante. En esta revisión se analizan ciertos aspectos de la constitución genética del hospedero que condcionan la respuesta inmune frente a los agentes causales de las micosis sistémicas y se señalan las similitudes y las diferencias entre ellos

Fibrotic sequelae in pulmonary paracoccidioidomycosis: histopathological aspects in BALB/c mice infected with viable and non-viable Paracoccidioides brasiliensis propagules

Patients with paracoccidioidomycosis often present pulmonary fibrosis and exhibit important respiratory limitations. Based on an already established animal model, the contribution of viable and non-viable P. brasiliensis propagules to the development of fibrosis was investigated. BALB/c male mice, 4-6 weeks old were inoculated intranasally either with 4x10(6 )viable conidia (Group I), or 6.5x10(6) fragmented yeast cells (Group II). Control animals received PBS. Six mice per period were sacrificed at 24, 48, 72h (initial) and 1, 2, 4, 8, 12 and 16 weeks post-challenge (late). Paraffin embedded lungs were sectioned and stained with H&E, trichromic (Masson), reticulin and Grocott's. During the initial period PMNs influx was important in both groups and acute inflammation involving 34 per cent to 45 per cent of the lungs was noticed. Later on, mononuclear cells predominated. In group I, the inflammation progressed and granulomas were formed and by the 12th week they fussed and became loose. Thick collagen I fibers were observed in 66.6 per cent and 83.3 per cent of the animals at 8 and 12 weeks, respectively. Collagen III, thick fibers became apparent in some animals at 4weeks and by 12 weeks, 83 per cent of them exhibited alterations in the organization and thickness of these elements. In group II mice, this pattern was different with stepwise decrease in the number of inflammatory foci and lack of granulomas. Although initially most animals in this group had minor alterations in thin collagen I fibers, they disappeared by the 4th week. Results indicate that tissue response to fragmented yeast cells was transitory while viable conidia evoked a progressive inflammatory reaction leading to granuloma formation and to excess production and/or disarrangement of collagens I and III; the latter led to fibrosis.